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Die chemische Genproduktion oder -synthese ist eine entscheidende Säule der modernen Molekularbiologie und hilft bei der Produktion ganzer nativer Gene und neuer Gene (solcher, die nicht natürlich vorkommen). Darüber hinaus ist der Prozess die Grundlage für die Produktion ganzer Genome (des vollständigen Satzes genetischer Anweisungen, die in einer lebenden Zelle vorhanden sind).
Fortschritte in der Gensynthesetechnologie bedeuten, dass Interessenten vielfältige Methoden zur Genproduktion zur Verfügung stehen. Allerdings hat jede Methode ihre Nischenanwendung, nämlich die Synthese spezifischer Gene, und eine Technik kann eine andere nicht ersetzen. Daher finden Sie im Folgenden einen Überblick über die gängigen Gensynthesetechniken und ihre Eigenschaften, um Sie bei der Auswahl Ihrer Methode für verschiedene Projekte zu unterstützen.
Die synthetische Genproduktion ist ein schrittweiser Prozess, der die Produktion eines Gens und anderer Genprodukte ermöglicht, ohne auf eine DNA-Vorlage angewiesen zu sein. Daher erleichtert es die Produktion verschiedener Gene, einschließlich benutzerdefinierter Gene mit modifizierten Sequenzen oder Basenpaaren.
Wie oben erwähnt, führen Fortschritte in der Biotechnologie dazu, dass es mehrere Techniken zur synthetischen Genproduktion gibt. Allerdings basieren alle Techniken auf dem natürlichen Genproduktionsprozess eines lebenden Organismus als Grundlage für die chemische Genproduktion, mit hier und da geringfügigen Modifikationen.
Daher hilft das Verständnis des grundlegenden Gensyntheseprozesses, die Nuancen zwischen den Gensynthesetechniken besser zu verstehen. Nachfolgend finden Sie eine Übersicht über die Schritte der Gensynthese.
Oligonukleotide sind kurze Nukleinsäurestränge (DNA oder RNA) und fungieren als Baustein für die Produktion jeglicher Genprodukte, einschließlich der Peptid- und Proteinsynthese. Verschiedene Gensynthesemethoden verwenden unterschiedliche Reagenzien und Techniken, um die Oligonukleotidsynthese zu initiieren. Allerdings bewegt sich der Prozess bei allen Methoden in einer 3'- bis 5'-Richtung.
Beim Annealing werden Moleküle wie Oligonukleotide erhitzt, bevor sie allmählich abgekühlt werden, um die Hybridisierung oder die Bildung einer chemischen Bindung zwischen zwei Molekülen zu erleichtern. Verschiedene Gensynthesemethoden nutzen einzigartige Vernichtungstechniken, um eine vollständige Gensequenz zu bilden.
Beim Klonen werden Kopien der neu gebildeten Gensequenz mithilfe eines Klonierungsvektors repliziert.
Die Gensynthese ist kein perfekter Prozess. Daher ist ein Klon-Screening erforderlich, um das Zielgen innerhalb der Klone zu identifizieren. Zu den beliebten Screening-Tools gehören ELISA-Kits und Chromatographie.
Neben der Identifizierung des Zielgens ist eine gründliche Analyse der Basenpaare in der Sequenz erforderlich. Darüber hinaus sorgen Korrekturmaßnahmen zur Korrektur von Replikationsfehlern wie Basendeletion und -substitution für die gewünschte Plasmidplatzierung.
Nachfolgend finden Sie eine Übersicht über die beliebtesten Methoden und Anwendungen der Gensynthese.
Die Festphasensynthese ist eine klassische Gensynthesemethode und beinhaltet die Verwendung chemisch modifizierter Nukleoside, einschließlich blockierter Nukleinsäuren (LNAs), zur Synthese von Zieloligonukleotiden. Eine Reagenzsäule, die eine Deblockierungssäure enthält, enthält die Nukleoside, die nach und nach eine Oligonukleotidkette bilden, wobei die Schutzgruppen nachfolgender Nukleoside entfernt werden.
Der enzymatische Zusammenbauprozess umfasst die Deblockierung (Entschützung) der Nukleoside, gefolgt von der Kopplung, Verkappung und Oxidation, um aus den neu gebildeten Oligonukleotiden eine Gensequenz zu bilden. Die Festphasensynthese ist ein vollautomatischer Prozess, und die Forscher sammeln am Ende die Gene. Zu seinen Vorteilen gehört eine bemerkenswert hohe Genauigkeit der Gensequenz.
Der Entschützungsprozess erhöht jedoch die Wahrscheinlichkeit von Nebenreaktionen und die Risiken nehmen mit zunehmender Länge zu. Daher produziert die Festphasensynthese nur Gene mit einer Länge von 15–25 Basen (maximal 200 Nukleotidreste). Solche Gene finden Anwendung in der Molekularbiologie und Medizin, unter anderem als Antisense in der Proteinsynthese oder als Sonden zum Nachweis komplementärer genetischer Materie.
Die Chip-basierte DNA-Synthese ist ein Gensyntheseprozess der nächsten Generation. Im Gegensatz zur Festphasensynthese, bei der es sich um einen chemischen Prozess handelt, handelt es sich bei der Chip-basierten Synthese um einen elektrochemischen Prozess.
Die Methode nutzt Mikroarray-Halbleiterchips, die mit Temperaturkontrollen ausgestattet sind, um mehrere Oligonukleotide in einer Einstellung zu erzeugen. Die Chip-basierte Synthese ergänzt den traditionellen chemischen Prozess des Phosphoramidit-Zyklus, indem sie Taschen mit temperaturkontrollierten Zonen schafft, die als virtuelle Vertiefungen/Inseln bezeichnet werden, was die Selektivität erleichtert.
Darüber hinaus erleichtert es die Fehlererkennung und -korrektur während des Oligonukleotid-Assemblierungsprozesses und erfordert keine separate Sequenzanalyse und Fehlerkorrekturphase. Zu den Vorteilen der Chip-basierten Synthese gehören ein hoher Durchsatz und die Möglichkeit, Genfragmente mit längeren Basenpaaren zu erzeugen. Die Technik erzeugt Gensequenzen für Anwendungen, die ein hohes Ziel-DNA-Volumen und eine geringe Genauigkeit erfordern.
Die PCR-Gensynthese (Polymerase-Kettenreaktion) ist ein klassischer Prozess, bei dem in zwei Schritten unter Verwendung von Primern Millionen von Genfragmenten hergestellt werden. Der erste Schritt besteht darin, überlappende Nukleotide durch eine selbstprimierende Kettenreaktion zusammenzusetzen, um ein 60-bp-Oligonukleotid zu erzeugen, das die gesamte Sequenz abdeckt.
Zweitens erzeugt eine anschließende PCR-Reaktion DNA-Fragmente mit einer Länge von 400–500 bp. Ein zusätzlicher Primer verstärkt das Ziel-DNA-Fragment. Die Methode ist ideal für Anwendungen, die hochgenaue, lange Genfragmente erfordern.
Die Array-basierte Gensynthese ist aufgrund ihres geringen Reagenzienverbrauchs wohl der kostengünstigste Genproduktionsprozess. Zweitens verfügt das Verfahren über eine Multiplex-Kapazität und produziert Tausende bis Zehntausende Oligonukleotidsequenzen.
Obwohl die verschiedenen Oligonukleotidsequenzen ein Pluspunkt sind, ist der Zusammenbau der Oligonukleotide zu lebensfähigen Genfragmenten aufgrund der Sequenzhomologie eine Herausforderung. Daher ist die Methode ideal für kundenspezifische Gensyntheseprozesse, die viel geringere Mengen an Genfragmenten erfordern.
Die Flüssigphasen-Gensynthese ist ebenfalls eine klassische Technik, die in vielen Elementen der Festphasensynthese ähnelt. Anders als bei der Festphasensynthese erfolgt die Oligonukleotiderzeugung jedoch in einer Lösung und nicht auf einem Säulenträger. Außerdem weist die Flüssigphasen-Gensynthese ein geringeres Risiko von Seitenkettenreaktionen auf und kann mit minimalen Fehlern, wenn auch langsamer, lange DNA-Fragmente erzeugen.
Gensynthesetechniken entwickeln sich ständig weiter, um der steigenden Nachfrage nach qualitativ hochwertigen Genen, Kosteneffizienz und Skalierbarkeit gerecht zu werden. Bei den oben hervorgehobenen Methoden handelt es sich um die primären Genproduktionsmethoden. Sie können Ihren Dienstleister bezüglich der idealen Methode für Ihr Projekt und Budget konsultieren.
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