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Die chemische Genproduktion bzw. -synthese ist ein zentraler Pfeiler der modernen Molekularbiologie und ermöglicht die Herstellung vollständiger, natürlicher Gene sowie neuartiger Gene (solcher, die nicht natürlich vorkommen). Darüber hinaus bildet dieses Verfahren die Grundlage für die Produktion ganzer Genome (des vollständigen Satzes genetischer Informationen einer lebenden Zelle).
Fortschritte in Gensynthesetechnologie ermöglichen es, vielfältige Methoden zur Genproduktion zu nutzen. Jede Methode hat jedoch ihren spezifischen Anwendungsbereich, die Synthese bestimmter Gene, und keine Technik ist durch eine andere ersetzbar. Daher bietet die folgende Übersicht einen Überblick über die gängigen Gensynthesetechniken und ihre Eigenschaften, um Ihnen die Wahl der Methode für Ihr Projekt zu erleichtern.
Die synthetische Genproduktion ist ein schrittweiser Prozess, der die Herstellung eines Gens und anderer Genprodukte ohne DNA-Vorlage ermöglicht. Dadurch wird die Produktion verschiedenster Gene, einschließlich maßgeschneiderter Gene mit veränderten Sequenzen oder Basenpaaren, erleichtert.
Wie bereits erwähnt, haben Fortschritte in der Biotechnologie zur Existenz zahlreicher synthetischer Genproduktionsverfahren geführt. Allen diesen Verfahren liegt jedoch der natürliche Genproduktionsprozess lebender Organismen als Grundlage für die chemische Genproduktion zugrunde, wobei hier und da geringfügige Modifikationen vorgenommen werden.
Daher hilft das Verständnis des grundlegenden Gensyntheseprozesses, die Nuancen der verschiedenen Gensynthesetechniken zu verstehen. Im Folgenden finden Sie eine Übersicht der einzelnen Schritte der Gensynthese.
Oligonukleotide sind kurze Nukleinsäurestränge (DNA oder RNA) und dienen als Bausteine für die Herstellung von Genprodukten, einschließlich Peptid- und Proteinsynthese. Verschiedene Gensynthesemethoden verwenden unterschiedliche Reagenzien und Techniken, um die Oligonukleotidsynthese zu initiieren. Der Prozess verläuft jedoch bei allen Methoden in 3'-5'-Richtung.
Beim Annealing werden Moleküle wie Oligonukleotide erhitzt und anschließend langsam abgekühlt, um die Hybridisierung, also die Bildung einer chemischen Bindung zwischen zwei Molekülen, zu ermöglichen. Verschiedene Gensynthesemethoden nutzen spezifische Annihilationstechniken, um eine vollständige Gensequenz zu erzeugen.
Beim Klonen werden Kopien der neu entstandenen Gensequenz mithilfe eines Klonierungsvektors vervielfältigt.
Die Gensynthese ist kein perfekter Prozess. Daher ist ein Klon-Screening notwendig, um das Zielgen innerhalb der Klone zu identifizieren. Gängige Screening-Methoden sind ELISA-Kits und Chromatographie.
Neben der Identifizierung des Zielgens ist eine gründliche Analyse der Basenpaare in der Sequenz erforderlich. Darüber hinaus gewährleisten Korrekturmaßnahmen zur Behebung von Replikationsfehlern wie Basendeletionen und -substitutionen die gewünschte Platzierung des Plasmids.
Nachfolgend finden Sie eine Übersicht der gängigsten Methoden zur Gensynthese und ihrer Anwendungen.
Die Festphasensynthese ist eine klassische Methode der Gensynthese und beinhaltet die Verwendung chemisch modifizierter Nukleoside, einschließlich Locked Nucleic Acids (LNAs), zur Synthese von Ziel-Oligonukleotiden. Eine Reagenzsäule mit einer Entblockierungssäure hält die Nukleoside, die durch die Abspaltung der Schutzgruppen sukzessive eine Oligonukleotidkette bilden.
Der enzymatische Assemblierungsprozess umfasst die Entblockierung (Entschützung) der Nukleoside, gefolgt von der Kopplung, dem Capping und der Oxidation zur Bildung einer Gensequenz aus den neu entstandenen Oligonukleotiden. Die Festphasensynthese ist ein vollautomatisierter Prozess, und die Forscher gewinnen die Gene am Ende. Zu ihren Vorteilen zählt eine bemerkenswert hohe Genauigkeit der Gensequenz.
Die Abspaltung der Schutzgruppen erhöht jedoch die Wahrscheinlichkeit von Nebenreaktionen, und die Risiken steigen mit zunehmender Sequenzlänge. Daher werden mittels Festphasensynthese nur Gene mit einer Länge von 15–25 Basen (maximal 200 Nukleotidreste) hergestellt. Solche Gene finden Anwendung in der Molekularbiologie und Medizin, beispielsweise als Antisense-RNA in der Proteinsynthese oder als Sonden zum Nachweis komplementärer genetischer Substanzen.
Die chipbasierte DNA-Synthese ist ein Gensyntheseverfahren der nächsten Generation. Im Gegensatz zur Festphasensynthese, die ein chemisches Verfahren ist, handelt es sich bei der chipbasierten Synthese um ein elektrochemisches Verfahren.
Das Verfahren nutzt mit Temperaturreglern ausgestattete Mikroarray-Halbleiterchips, um in einem einzigen Arbeitsgang mehrere Oligonukleotide zu erzeugen. Die chipbasierte Synthese ergänzt den traditionellen chemischen Phosphoramidit-Zyklus durch die Schaffung von Bereichen mit kontrollierter Temperatur, sogenannten virtuellen Vertiefungen/Inseln, was die Selektivität erhöht.
Darüber hinaus erleichtert es die Fehlererkennung und -korrektur während der Oligonukleotid-Assemblierung und erfordert keine separate Sequenzanalyse und Fehlerkorrektur. Zu den Vorteilen der chipbasierten Synthese zählen der hohe Durchsatz und die Möglichkeit, Genfragmente mit längeren Basenpaaren zu erzeugen. Das Verfahren eignet sich zur Herstellung von Gensequenzen für Anwendungen, die ein hohes Ziel-DNA-Volumen und eine geringe Genauigkeit erfordern.
Die PCR-Gensynthese (Polymerase-Kettenreaktion) ist ein klassisches Verfahren, das in zwei Schritten mithilfe von Primern Millionen von Genfragmenten erzeugt. Im ersten Schritt werden überlappende Nukleotide durch eine selbstprimierende Kettenreaktion zu einem 60 bp langen Oligonukleotid zusammengefügt, das die gesamte Sequenz abdeckt.
In einem zweiten Schritt erzeugt eine nachfolgende PCR-Reaktion DNA-Fragmente von 400–500 bp Länge. Ein zusätzlicher Primer amplifiziert das Ziel-DNA-Fragment. Das Verfahren eignet sich ideal für Anwendungen, die hochpräzise, lange Genfragmente erfordern.
Die Gensynthese mittels Arrays ist aufgrund ihres geringen Reagenzienverbrauchs wohl das kostengünstigste Genproduktionsverfahren. Zudem ermöglicht die Methode die Multiplex-Produktion von Tausenden bis Zehntausenden von Oligonukleotidsequenzen.
Die Vielfalt der Oligonukleotidsequenzen ist zwar ein Vorteil, die Assemblierung der Oligonukleotide zu funktionsfähigen Genfragmenten gestaltet sich jedoch aufgrund der Sequenzhomologie schwierig. Daher eignet sich die Methode ideal für kundenspezifische Gensyntheseprozesse, die deutlich geringere Mengen an Genfragmenten erfordern.
Die Flüssigphasen-Gensynthese ist ebenfalls eine klassische Technik, die in vielen Aspekten der Festphasensynthese ähnelt. Im Gegensatz zur Festphasensynthese erfolgt die Oligonukleotidbildung jedoch in Lösung und nicht auf einem Säulenträger. Zudem birgt die Flüssigphasen-Gensynthese ein geringeres Risiko für Seitenkettenreaktionen und ermöglicht die Erzeugung langer DNA-Fragmente mit minimalen Fehlern, wenn auch langsamer.
Die Techniken der Gensynthese werden stetig weiterentwickelt, um der steigenden Nachfrage nach qualitativ hochwertigen Genen, Kosteneffizienz und Skalierbarkeit gerecht zu werden. Die oben genannten Methoden sind die wichtigsten Verfahren zur Genproduktion. Ihr Dienstleister kann Ihnen die optimale Methode für Ihr Projekt und Ihr Budget empfehlen.
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